Культура клетки из сыворотки крови (серума)

Технология исследований на основе культуры клетки применяется практически во всех областях биомедицинских исследований и экспериментов.

С самых первых дней эта технология включает в себя использование  сыворотки крови животных - серума для обеспечения питательной среды, а также для других неубедительно обоснованных причин.  Эта практика продолжается и по сей день  не смотря на низкую техническую эффективность  использования серума, его высокую стоимость,  и не смотря на все увеличивающийся выбор альтернатив без животной плазмы и серума. 

Растающая обеспокоенность фактом причинения страданий животным ради получения сыворотки их крови добавили еще и этические соображения в пользу отхода от использования серума.

ПОЛУЧЕНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ ИЗ ЗАРОДЫШЕЙ ТЕЛЯТ

В то время как серум может быть получен от различных видов животных, наиболее предпочтимым источником считается теленок в чреве матери.  Сыворотка крови приготавливается из крови телят, извлекаемых из забиваемых на бойне матерей-коров.

Процесс забора крови и масштаб причиняемых страданий был описан в деталях в статьеAlternatives to Laboratory Animals 2002, 30: 219-27
В нескольких словах: теленок извлекается из тела коровы во время вспарывания ее брюшной части, обмывается, пуповинный жгут обрывается, и затем  при помощи иглы, введенной в сердце, из теленка вытягивается кровь - без какой либо анестезии.

В последние годы повысилась озабоченность тем , что зародыш испытывает страдания и чувствует боль, а также накопился достаточный объем доказательств, показывающий, что мозг млекопитающих устойчив к аноксии, или повреждению при родах.  Таким образом, телята, извлеченные из чрева матери, вполне возможно находятся в полном сознании со здоровой функцией мозга, и во время процедуры извлечения крови через введенную в их сердце иглу скорее всего испытывают страдания до самого момента наступления смерти.

По оценкам, от одного до двух миллионов зародышей телят ежегодно подвергаются этому процессу, в то время как огромное колличество ученых,регулярно использующих сыворотку крови этих существ, не имеют понятия о том, какие страдания причиняет процесс забора их крови.

ТЕХНИЧЕСКИЕ СООБРАЖЕНИЯ ПРОТИВ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЖИВОТНЫХ

Сыворотка крови животных остается в большой степени неизученным комплексом множества компонентов, из которых на настоящий момент определены около 200.  Эффект этих неизученных компонентов на культуру клетки  пока не совсем выявлен, и существуют некоторые доказательства, что в серуме присутствуют цитотоксины, производящие негативное воздействие на первичные и установившиеся клеточные линии.

Состав сыворотки может очень сильно варьировать.  Поэтому лаборатории вынуждены анализировать каждую партию сыворотки перед употреблением - процесс как дорогостоящий так и занимающий большое колличество времени.  Значительные различия состава партий сыворотки затрудняют контроль за состоянием культуры клетки, а также различные партии сыворотки могут паказывать различные результаты в анализах (assays) клеточных линий. 

В дополнение к упомянутому, серум может также создавать благоприятную среду для различных загрязнителей, таких как: вирусы, бактерии, прионы и майкоплазмы.

Высокая стоимость серума (качественная сыворотка крови животного может стоить до 500 фунтов стерлингов за литр) также говорит в пользу использования альтернатив в исследованиях на культуре клетки.  А  неравномерные по времени поставки иной раз приводят к дефициту серума.
По некоторым оценкам 55% общей стоимости экспериментирования на культуре клетки приходятся на серум, в то время как последний составляет только 5% состава медиума.


КУЛЬТУРА КЛЕТКИ БЕЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЖИВОТНЫХ.

В идеале для культуры клетки требуется определенный и постоянный в своих свойствах медиум.  В прошлом исследователи столкнулись с рядом трудностей при попытках культивировать клетки без серума.

В настоящее же время колличество компаний,  производящих медиум без серума, постоянно растет, и в таком медиуме может быть успешно и без потерь жизнеспособности культивирован широкий круг различных типов клеток.

Focus on Alternatives (FOA) Фокус на Альтернативы - группа, объединяющая организации,  пропагандирующие альтернативы экспериментам на животных, провела анализ существующих рыночных возможностей  приобретения медиума без серума для культуры клетки.

На момент исследования было найдено 28 компаний, производящих целый диапазон медиумов без серума.  А детальное описание 200 компаний было занесено в таблицу, дающую имя компании-поставщика, состав медиума, спектр его применения и типы клеток, которые питает каждый продукт.
Медиумы, полностью свободные от животного продукта, были выделены особо, а индексирование помогало исследователям без труда находить наиболее подходящие для конкретного типа клеток продукты.

Диапазон предлагаемых медиумов без серума для различных типов клеток весьма широк.  С недавнего времени благодаря крупно масштабному производству биофармацевтических препаратов, для которых необходима идеально чистая среда, что означает медиум без серума,  исследованиям в этой области уделяется особое внимание.
Ряд медиумов без серума был разработан и оптимизирован для поддержки специфических типов клеток, как например таких  коммерчески важных клеточных линий как CHO, Vero, MDCR, а также гидромассы моноклональных антител.  Другие медиумы разрабатываются для культуры общего применения и они могут поддерживать широкий круг различных клеток, используемых для исследований.

Даже те медиумы, которые разработаны для специфических целей, часто могут быть использованы в более широком круге исследований.  Некоторые компании  прилагают информацию их клиентов об успехе применения медиумов для других клеток в дополнение к тем, для которых  продукт был создан изначально.

СОСТАВ МЕДИУМОВ БЕЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ.

Некоторые производители предлагают заменитель сыворотки животной крови, которые могут быть добавлены в культуру медиума вместо серума. 
Но в основном компании выпускают уже готовый,  полностью свободный от сыворотки животной крови, медиум, с сопроводительными инструкциями как "приучить" клетки в среде без серума.

Большинство медиумов состоят из базового медиума, к которому добавляются различные компоненты (аминокислоты, специфические добавки, витамины, ускорители роста и т.д.), которые могут быть либо животного происхождения, либо взятыми от человека, либо комбинациями двух предшедствующих, а также из растительных источников.

По определению, медиум без серума не включает в себя цельную сыворотку животной крови (серум) , но может включать производные серума.  Например, белковый компонент медиума без серума является албумином сыворотки крови теленка.

Организация "Фокус на Альтернативы" FOA пока не достаточно обратила внимание на другие компоненты, изготовленные на животной основе, ее основной заботой является извлечение крови из живых зародышей-телят.  Продукты, извлеченные из взрослых животных, могут порой вовлекать меньше страданий, но предпочтение отдается продуктам полностью свободным от животных компонентов.

Многие компании представляют детальный состав  медиумов без серума для интересующихся исследователей.  Некоторые публикуют список ингредиентов на своих сайтах.  Однако в условиях конкуренции рынка, когда  на медиумы без животной сыворотки - серума наблюдается повышенный спрос, отдельные компании, выпускающие медиумы без серума, держат список ингредиентов их патентованной продукции в секрете.  Это является затруднением для тех исследователей, которые ищут продукцию, ПОЛНОСТЬЮ СВОБОДНУЮ от животных компонентов, а не
только от серума.

МЕДИУМЫ БЕЗ ЖИВОТНЫХ КОМПОНЕНТОВ

Наиболее чистая и постоянная по составу среда для культуры клетки - это медиум с четко определенными ингредиентами и полностью свободный от животных компонентов.
Некоторые компании предлагают такую продукцию, и она выделена особым образом в указанной выше информационной таблице, составленной  FOA.

Такие полностью определенные по составу медиумы, не содержащие каких либо животных компонентов, способны поддерживать различные виды клеток, включая HeLa, клетки рака груди, клетки почек, CHO, стволовые клетки, панкреатитные островковые клетки, а также производство гидромасс моноклональных антител.

В производстве клеточных культур, используемых для биофармацевтических препаратов клинического применения, особенно важно использовать как можно более чистую питательную среду.  Существует несколько компаний, чья продукция ориентирована на этот аспект.  Компания Hyclone имеет производственную площадь, обозначенную "без компонентов животного происхождения", а компания Gibco Invitogen располагает компьютерной базой данных сырья, позволяющей ее клиентам распознавать компоненты животного происхождения.

На настоящий момент примерно одна треть продуктов биотехнологии приходится на моноклональные антитела.
Которые по обычаю выращивают в медиуме с довольно высокой концентрацией серума - сыворотки крови животных (5-20%).  Вместе с тем несколько компаний предлагают для продажи специально сформулированные без серума медиумы для гидромасс, которые производят повышенный выход моноклональных антител, а также упрощают производство по сравнению с предыдущими медиумами, содержащими серум.

ОТЛУЧЕНИЕ КЛЕТОК ОТ СРЕДЫ С СЫВОРОТКОЙ КРОВИ И ИХ ВЫРАЩИВАНИЕ В НОВЫХ УСЛОВИЯХ

Чтобы заставить клетки расти в медиуме без сыворотки животной крови, обычно применяетя метод постепенного отлучения.  Компания Cambrex считает, что некоторые массы клеток могут довольно быстро приспосабливаться к медиуму без серума, если клетки подвергнуть пеллетированию (уплотнению) и затем опять размешать  в медиуме без серума.  Как правило чем чище медиум с низким содержанием или отсутсвием белка - тем больше внимания надо уделять процессу отлучения.

Некоторые компании предлагают ограниченный диапазон клеток, уже приспособленных к их продукции, медиуму без серума. Например,  Gibco Invitrogen поставляет клеточные линии почек человеческого эмбриона, CHO, COS-7L, первичные кератиноциты человека, а также различные клеточные линии насекомых, уже приспособленных к медиуму без серума.

Во время отлучения необходимо наблюдать за клеточным функционированием, так как изменения условий среды могут влиять на различные аспекты клеточной деятельности, которые иной раз могут быть теми аспектами, которыми интересуется исследователь.

Тем не менее те преимущества, которые даст переход к новому методу, как правило вполне оправдывают усилия, потраченные на переход.

Многие компании сообщают, что их медиум без сыворотки крови животных может помочь получить лучшие результаты, чем при помощи аналогичных медиумов с серумом.  Они предлагают сравнительный анализ данных, из которого видно, что для определенных видов клеток их выход  либо сравним,  либо превосходит тот, для выращенных в среде с серумом:  по плотности клеточной массы или по большему выходу клеток.

После того как клетки приспособятся к новому медиуму, исследователи оказываются в более выгодной позиции, так как облегчается контроль за условиями клеточной культуры, устраняется вмешательство загрязнителей, улучшается плодовитость культуры, устраняется цитотоксичность от сыворотки животной крови, и постоянный по составу медиум не требует анализа каждой партии.

БУДУЮЩЕЕ БЕЗ FCS -Fetal Calf Serum (БЕЗ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЗАРОДЫШЕЙ ТЕЛЯТ)

"Фокус на Альтернативы" стремится к тому, чтобы прекратить широко распространенное применение серума зародышей телят.  Организация убеждена, что уже имеющиеся на рынке  продукты без серума в сочетании с новыми разработками могут положить конец использованию сыворотки крови зародышей телят.

К этому подталкивают как моральные так и законодательные требования: European Directive 86/609/EEC  Европейская Директива обязывает ученых использовать альтернативы везде, где они возможны. 
Уже на сей день культура клетки показала себя как важная альтернатива процедурам тестирования на живых животных.  К примеру производство вакцины от полиомелита, осуществленное с помощью культур клетки, спасло жизнь тысячам обезьн, а инвитро (пробирочное) производство моноклональных антител заменило процесс выращивания их в живых мышах. 
Вполне очевидно, что методы использования клеточных культур играют важную роль в области альтернатив, и исключение применения сыворотки крови животных, в частности сыворотки крови зародышей телят, сделают эту роль еще более значимой для освобождения животных.

Экономические причины и требования безопасности заставили биофармацевтическую индустрию переходить на производство в условиях использования медиума без серума, и это в свою очередь проложило путь для следования со стороны биомедицинских исследований.

Отлучение клеток от питательной среды, содержащей сыворотку животной крови, и перевод на медиум без серума могут стоить исследователям определенных усилий, но они будут многократно оправданы последовательностью и качеством результатов.
"Фокус на Альтернативы" призывает всех пользователей клеточных культур сделать попытку для перехода на медиум без серума.

Связаться с "Фокусом на Альтернативы" FOA можно по адресу
carol@drhadwentrust.org.uk или через веб сайт
www.focusonalternatives.org.uk